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Bioss讲堂|IHC之石蜡切片16种常见问题全解析
发表者:北京博奥森生物      发表时间:2018-11-19

本期导读:样本的制备是IHC实验成功的前提条件。样本完成石蜡包埋后,需要成约3-4um的薄片。本文主要介绍了切片小技巧及过程中容易出现的16种问题(点击获取全部列表进行了一一分析。


切片小技巧

① 组织切片,旧刀修片,新刀切片。

②切片厚度3-4μm(淋巴结、扁桃体、鼻咽、扁桃体2-3μm;脂肪5-6μm)

③切片毛笔应顺着刀背往刀锋扫。

④切片动作轻,用力均匀。

⑤室温、冷冻等温度要适宜,易于切出薄片。

⑥刀片锋利,切片角度5°最佳,切片平整无褶皱和收缩。

⑦切片方向:纤维、肌肉走向与切片平行;原则为软→硬,易→难,主→次。

⑧蜡块表面有钙点,应20%HCL表面泡1-2h,水洗后切。

⑨切片人员应细心操作,防划伤,切后维护保养机器。



展片、捞片、烤片注意事项

切片光面朝下展片、捞片。

避免切片被污染。

摊片水温利于展平又不熔化,必要时用20%酒精摊片。

用镊子辅助将组织贴在玻片合适的位置。

细小组织(穿刺、内镜小标本)可以多贴几个。

玻片干净,防止脱片(血块、脑组织、脂肪)。

在烘烤切片前应做好排水,烤片温度高于石蜡熔点5-10℃


切片常见的16种问题及解决方法

问题1 细胞皱缩和收缩;核“起泡”变大损伤;胶原染色嗜碱性

原因:石蜡温度过高。

解决方法:烤箱温度高于石蜡熔点5-10℃为佳。


问题2 切片卷成致密团

原因:①刀钝;②倾斜角太小;③切片太厚。

解决方法:①换新刀片;②如果间隙角充分,降低倾刀的斜度。


问题3 切片破碎或切不成片

原因:①组织固定、脱水、透明不彻底,浸蜡不透;浸蜡包埋温度过高或时间过久。

解决方法:①优化组织处理;②及时更换试剂;③重新脱水补救;或者重取。


问题4 过分的压缩

原因:刀片钝;组织或石蜡过软;用力太猛,速度太快。

解决方法:①换刀片,移刀锋;使组织表面变冷,重新切取;动作轻,用力均匀。


问题5 切片不成连片
原因:刀刃不锋利,刀间隙角度大;蜡块内组织上下端留蜡边太少或不整齐,刀边碎片;室温过低或石蜡过硬。

解决方法:移动刀口或更换刀片,检查刀的角度,清洁刀片和刀架背面;在低熔点的石蜡中重新包埋;提高室内温度或温暖蜡块表面(哈气等);切片厚度适宜(根据组织类型)。


问题6 切片易粘附与组织块

原因:间隙角不足;室温过高或包埋石蜡熔点低;刀片、组织块边缘的碎片;组织带静电。

解决方法:增加间隙角;清洁刀边;修剪组织块的边缘;湿润切片机周围的空气,地上洒水,开启加湿器;⑤放置静电防护器或切片机附近放置干燥板。


问题7 切片条带弯曲不直

原因:①蜡块上下两面不平行;②蜡块下边与刀口不平行;③切片处刀锋不一致;④组织本身硬度不一致。

解决方法:①重新修整蜡块,使上下两边平行;②将蜡块移正,与刀口保持平行;③移动刀片或更换刀片;④修去组织较软侧的蜡块。


问题8 蜡块组织脱落

原因:①在粗修蜡块时,先放组织后放蜡,否则组织与包埋蜡块黏贴不牢;②蜡块冻时间过长,切片时易出现蜡块脱落现象。

解决方法:①包埋先放石蜡后放组织,速度尽可能快;②切片动作小、匀速。


问题9 组织切片不完整,缺损

原因:①取材时未取中病灶,组织块太大,太厚;②多块组织包埋是排列不佳;③组织块内组织不平坦;④组织包埋方向失误;⑤切片时粗修过多(切削过深)或过少(没切到足够的深度)。

解决方法:①组织太大,脱水 不好,取材厚度3mm为佳;②组织在包埋模中均匀铺平;③熟悉各种组织的切片特点,避免包埋方向的失误(囊壁、管腔竖直包埋);④切片方向:软到硬,易到难,主到次。


问题10 切片过厚

原因:①切片机维护不当,切片厚度设置错误;②石蜡太软(熔点低);③石蜡过热;④刀钝。

解决方法:①降低切片厚度设置;②定期校准和保养;③使用适合组织类型和密度熔点的石蜡;④常规病理组织切片厚度在3-4μm,淋巴结、脾脏、胸腺、鼻咽组织等含巴细胞成分较多的组织,薄切2-3μm,脂肪5-6μm。


问题11 切片纵裂,损伤,刀痕

原因:①组织中钙化点、钉、缝合线或纸屑等异物;②刀片缺口;3刀口不洁,含有毛屑、碎组织、皮棉或石蜡等;④石蜡中有杂质。

解决方法:①更换刀片或移动刀口;②使用面脱钙方法(20%HCl);③仔细清洁刀刃以除去多余的石蜡堆积;④如果石蜡中有异物,用干净的石蜡重新包埋。


问题12 切片厚薄不均匀/跳刀/百叶窗/搓衣板

原因:①组织脱水过度;②切片刀不锋利,刀间隙角(或倾斜度)太大;③切片速度太快

④切片机部件松动或磨损;⑤组织致密或坚实;⑥主轴伸出太长。

解决方法:①处理过程中减少脱水时间;②更换刀片,减少倾斜度;③哈气;④均速慢切;⑤确保刀和组织的有关螺丝拧紧夹牢;⑥主轴摇回复原。


问题13 褶皱/折叠

原因:①摊片温度不合适,组织未充分伸展;②刀片不锋利,刀角度大;③石蜡熔点低,过软或室温较高;④组织缺乏一致性。

解决方法:①调小刀角度,边切边向蜡块吹气用10-20%酒精摊片,利用浓度差,水的张力来展片;②检查摊片水温,太冷不易展开;太热会产生褶皱或折叠,组织细胞散开;③更换刀片或移动刀口;④切片厚度是否合适。


问题14 切片裂缝/碎裂

原因:①组织固定和处理不完全,摊片是发生裂解;②摊片水温过高,摊片时间长导致过度延伸;③摊片时镊子撑开过大;④烤片前切片排水不净。

解决方法:①确保固定和处理完全;②在摊片时轻轻延伸蜡带,去除褶皱和折叠;③降低摊片水温(通常低于包埋蜡熔点的5-10℃);④在切片和漂片过程中,小心操作蜡带;⑤在烘烤切片前应很好的排水。


问题15 栅状裂和龟裂

原因:①固定、透明、浸蜡不充分;②摊片水温过高;③过度脱水,去除了蛋白质结合的水,组织发脆,当漂浮在水面上是可能会裂开;④切片过程中过度冷冻。

解决方法:①优化组织脱水过程;②降低摊片水温;③切片过程中勿使用冷却喷雾剂,细胞易缩小;④匀速慢切,边切边对蜡块吹气。


问题16 切片中有气泡

原因:捞片时切片下面有气泡。

解决方法:①保持温水干净,无杂质;②切片要干净无污染;③捞片前将组织下的气泡赶走。

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